Senin, 07 Januari 2013

Mikroteknik Tumbuhan; Laporan Praktikum pembuatan Preparat dengan metode parafin


LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROTEKNIK TUMBUHAN

 

PERCOBAAN I

PEMBUATAN PREPARAT MELINTANG DENGAN METODE PARAFIN

NAMA                                : RR. DYAH RORO ARIWULAN
NIM                                     : H411 10 272

KELOMPOK                    : III (TIGA)

ASISTEN                            : WITRI YULIANA
HARI/ TANGGAL                        : RABU/ 19 SEPTEMBER 2012




 

                                   LABORATORIUM BOTANI JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
                                                                                 MAKASSAR
2012


BAB I
PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang
Sel tumbuhan mempunyai bentuk, ukuran dan struktur yang bervariasi. Struktur sel rumit, namun demikian semua sel mempunyai persamaan dalam beberapa segi dasar. Jaringan yang menyusun tumbuh-tumbuhan terdiri dari jaringan muda dan dewasa. Jaringan-jaringan ini dapat ditemukan pada bagian akar, batang dan daun tumbuhan. Jaringan ini dapat dilihat dengan membuat suatu preparat penampang dari bagian-bagian tumbuhan (Johansen, 1940).
Tubuh tumbuhan terdiri atas kumpulan sel-sel, yang mempunyai asal, fungsi serta struktur yang sama dan disebut jaringan. Berdasarkan sifatnya,  ada dua macam jaringan yang menyusun tubuh tumbuhan, yaitu jaringan muda dan jaringan dewasa. Jaringan muda mempunyai sifat membelah, sehingga mempunyai fungsi menambah panjang akar maupun batang, karena biasanya terdapat pada bagian ujung. Pertumbuhan yang diawali oleh jaringan-jaringan yang letaknya di bagian ujung dikenal sebagai pertumbuhan primer, dan semua jaringan yang terbentuk jaringan primer. Tumbuhan monokotil melengkapi daur hidupnya hanya dengan pertumbuhan pimer saja, tetapi tumbuhan dikotil batang dan akar dapat mempertebal diri melalui proses yang disebut pertumbuhan sekunder (Sumardi dan Pudjoarinto, 2002).
Metode parafin termasuk metode irisan yang merupakan metode rutin atau standar. Metode ini sekarang banyak digunakan, karena hampir semua macam jaringan dapat dipotong dengan baik bila menggunakan metode ini. Preparat awetan jaringan tumbuhan adalah salah satu media pembelajaran biologi yang sangat efektif. Oleh karena itu dengan latar belakang seperti di atas, maka dilakukanlah percobaan ini dengan harapan kita dapat mengamati dan melihat preparat dengan menggunakan metode parafin.

I.2 Tujuan Percobaan
Tujuan dari dilakukannya percobaan ini adalah untuk mengamati dan melihat preparat secara melintang dari batang jagung Zea mays menggunakan metode parafin.

I.3 Waktu dan Tempat
Percobaan  ini dilaksanakan pada hari Rabu,  19 September 2012, pada pukul 11.40 – 14.30 WITA, bertempat di Laboratorium Botani, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar.














BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Suatu organisme baik tumbuhan maupun hewan adalah suatu unit kehidupan yang lengkap. Jika terorganisasi benar maka organisme mempunyai susunan yang memiliki organ, jaringan dan sel yang fungsi dan hubungannya merupakan ciri khas suatu individu maupun spesies. Dalam bentuk kehidupan yang paling sederhana suatu organisme dapat terdiri dari satu sel. Setiap organisme hidup ataupun hasil pertumbuhannya merupakan suatu sumber yang penting sebagai bahan mikroteknik. Tingkat kekerasan jaringan tumbuhan pada umumnya ditentukan oleh tingkat pertumbuhannya, yang dalam hal ini berkaitan dengan derajat pengayuan (lignifikasinya). Jaringan tumbuhan berbeda dengan jaringan hewan dalam satu hal penting yaitu bahwa setiap sel tumbuhan terbungkus yang cukup tangguh yang terutama terdiri dari selulosa. Membran tersebut berasal dari sel, sedangkan membran sitoplasma yang asli, yang sesuai dengan membran luar pada sel hewan berada sedikit di sebelah dalam  (Sugiharto, 1989).
            Semua sel yang menyusun tubuh tumbuhan dewasa berasal dari kegiatan sel-sel jaringan muda. Pada proses pencapaian dewasa sel-sel tersebut tidak hanya bertambah volumenya , tetapi strukturnya lebih termodifikasi untuk memenuhi fungsi fisiologis tertentu pada tumbuhan dewasa. Modifikasi untuk memiliki fungsi yang khusus tersebut dinamakan deferensiasi dan merupakan tahap pematangan sel (Sumardi dan Pudjoarinto, 2002).
Tubuh tumbuhan secara morfologi terdiri atas unit sel yang dilindungi oleh dinding, dan masing-masing sel dengan mengadakan kesatuan dengan adanya

substansi antar sel. Sel-sel dalam tubuh tumbuhan terdapat dalam kelompok yang
secara struktural dan fungsional berbeda dengan kelompok sel yang lain. Kelompok-kelompok sel-sel tersebut dikenal dengan jaringan (Johansen, 1940).
Mikroteknik atau teknik histologi ini akan dipelajari ilmu atau seni untuk mempersiapkan organ, jaringan atau bagian yang lainnya untuk dapat diamati dan dipelajari dengan lebih teliti. Pada umumnya untuk melihat jaringan atau organ ini dilakukan dengan bantuan mikroskop, karena struktur jaringan secara terperinci pada dasarnya terlalu kecil untuk dapat dilihat dengan mata telanjang. Suatu spesimen mikroteknik dapat merupakan sebagian ataupun keseluruhan dari struktur yang ditetapkan. Selain diletakkan pada kaca preparat, spesimen tadi umumnya dilindungi dengan kaca penutup, yaitu sepotong kaca yang sangat tipis ataupun plastik yang tembus pandangan yang direkatkan di atas specimen  (Sugiharto, 1989).
Banyak cara dalam pembuatan preparat jaringan tumbuhan, diantaranya adalah dengan metode parafin. Metoda ini sekarang banyak digunakan, karena hampir semua macam jaringan dapat dipotong dengan baik bila menggunakan metoda ini. Kebaikan-kebaikan metoda ini adalah irisan yang dihasilkan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metoda beku atau metoda seloidin. Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata diatas 10 mikron, tapi dengan metode parafin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini. Prosedurnya jauh lebih cepat dibandingkan dengan metode seloidin. Namun metode parafin juga memiliki kelemahan yaitu jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan, bila menggunakan metode ini. Sebagian besar enzim-enzim akan larut dengan metode ini (Imron, 2008).
Metode parafin termasuk metode sayatan yang banyak digunakan, karena hampir semua jaringan dapat dipotong dengan metode ini. Pengamatan secara mikroskopis dari suatu jaringan dalam berbagai kondisi dan berbagai elemen jaringan dapat diamati atau diteliti melalui preparat permanen yang dibuat dengan metode parafin. Pembuatan preparat dengan metode parafin adalah metode yang paling umum digunakan untuk pembuatan preparat permanen, baik pada tumbuhan ataupun pada hewan (Sugiharto, 1989).
Irisan utuh suatu spesimen sangat bermanfaat bagi studi pembelajaran. Dengan adanya preparat utuh maka dapat diamati bagian-bagian jaringan dan jenis sel yang ada dalam satu preparat. Dalam pembuatan preparat utuh diupayakan permanen atau awet agar sewaktu-waktu dapat diamati kembali.  Keberhasilan pembuatan preparat permanen ini tergantung pada lima tahap yang utama yaitu fiksasi, dehidrasi, penjernihan, perembesan dan pengeblokan parafin serta pewarnaan. Larutan fiksatif yang dipilih, perembesan parafin yang bagus dan zat warna yang akan digunakan menentukan keberhasilan preparat irisan (Imron, 2008).
Metode parafin merupakan cara pembuatan sediaan dengan menggunakan paraffin sebagai media penanaman (embedding). Langkah-langkah dalam pembuatan sediaan tersebut adalah (Rindi, 2011):
1.      Pematian dan fiksasi: Banyak larutan yang dapat digunakan untuk fiksasi, diantaranya adalah larutan FAA (Formaldehyde Acetic-acid Alcohol), dengan komposisi sebagai berikut: 50% atau 70% etilalkohol 90 cc, Asam asetat glacial 5 cc Formalin 40 % 5 cc. Setelah bahan dipotong kira-kira 0,5 cm segera dimasukkan ke dalam larutan FAA dengan perbandingan 1: 20 (bahan 1/20 volume FAA), tidak boleh lebih delapan potong didalam vial. Lama fiksasi dalam FAA bagi bahan yang kecil atau tipis minimum 12 jam sedangkan untuk bahan yang besar atau tebal 24 jam.
2.      Aspirasi: Aspirasi dilakukan dengan menggunakaan vakum (aspirator) dan digunakan dengan interval waktu yang pendek dan berkali-kali, dapat juga dengan menggunakan spet suntik. .
3.      Pencucian: Pencucian dilakukan 2 kali dalam waktu 3 jam dengan akohol 50%. Jumlah larutan dipakai hannya tepat menutupi bahan. 
4.      Dehidrasi dengan TBA (Tertier Butil Alkohol), serta infiltrasi: Dehidrasi dilakukan dengan campuran etilalkohol dan TBA dalam konsentrasi tertentu yang masing-masing dinamai larutan Johansen I sampai V.
5.      Penanaman (Embedding): Buat kotak keras yang agak tebal dengan ukuran kira-kira 5 X 2,5 X 2 cm- (panjang X lebar X tinggi), lalu isi dengan paraffin keras yang cair dalam vial tadi, kemudian sebelum parafin membeku masukkan bahan. Atur bahan tersebut dalam kotak kertas dengan menggunakan jarum yang dipanaskan dengan lampu alcohol atau spritus dan beri label. Setelah parafin membeku dan bahan tidak bergoyang, letakkan kotak kertas dalam air dingin. Biarkan permukaan parafin membeku, kemudian tekanlah seluruh kotak kedalam air sampai parafin membeku, atau dapat juga dimasukkan kedalam freezer sampai seluruh parafin sama sekali membeku. Baru setelah itu parafin dapat dikeluarkan dari kotaknya.
6.      Penyayatan: Potong balok parafin menjadi balok-balok kecil yang masing-masing mengandung sebuah bahan. Balok-balok parafin itu ditempelkan pada balok kayu menurut arah sayatan yang dikehendaki. Penempelan dilakukan dengan mencairkan sebagian balok parafin dengan jarum yang telah dipanasi, kemudian meletakkan balok parafin pada kayu. Lakukan hal itu beberapa kali sehingga balok parafin menempel dengan kuat pada balok kayu. Permukaan dari balok parafin yang telah ditempelkan sebaiknya empat persegi atu bujur sangkar. Perhatikan bahwa sisi horizontal harus benar-benar sejajar. Bahan yang ada dalam balok parafin disayat dengan mikrotom putar (rotary microtome). Sebelum dipotong balok yang telah ditempeli bahan dan pisau didinginkan dahulu dengan air dingin (kulkas), sehingga suhu parafin sama dengan suhu pisau. Balok kayu yang telah ditempel dengan balok parafin dipasang pada pemegang yang terdapat pada mikrotom. Aturlah tebal sayatan (biasanya antara 6-15 mikron) dengan memutar skrup pada sisi kanan mikrotom. Pasang pisau pada mikrotom. Pada waktu pemutar mikrotom dijalankan, bahan dalam parafin yang telah diletakkan pada pemegang bergerak naik turun dan maju kedepan. Peganglah sayatan-sayatan parafin yang berbentuk pita itu dengan kuas halus. Pita parafin hasil sayatan disimpan pada kotak karton atau baki preparat. Sebaiknya pemotongan dilakukan di ruangan ber-AC.
7.      Penempelan sayatan: Cara penempelan adalah sebagai berikut:
·         Teteskan larutan perekat pada kaca obyek sebesar tetesan kecil, gosok perekat tersebut sampai rata pada kaca obyek dengan ujung jari hingga membentuk lapisan tipis.
·         Teteskan larutan formalin diatas kaca obyek yang telah diberi perekat tadi. Letakkan sayatan diatasnya, dan letakkan kaca obyek tersebut diatas papan pemanas selama 30 menit. Usahakan agar sayatan paraffin merata pada permukaan kaca obyek. Amati dibawah mikroskop diseksi. Periksa apakah sayatan bahan telah rata benar.
·         Isaplah kelebihan larutan formalin yang terdapat pada sisi sayatan dengan kertas pengisap.

BAB III
METODE PERCOBAAN

III.1 Alat
Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah botol sampel, botol balsam, erlenmeyer, tabung ukur, pipet tetes, pipet skala, pinset, silet dan penggaris.

III.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah batang tanaman jagung Zea mays, Asam acetat glacial, aquades, Formalin, alkohol bertingkat 70%, 80%, 90%, dan 96%,  xylol,  parafin, selotip, dan kotak kubus.

III.3 Cara Kerja
            Cara kerja dari percobaan ini adalah:
1.      Menyediakan semua alat-alat yang akan digunakan di laboratorium dan membuat larutan-larutan yang diperlukan.
2.      Memotong jaringan batang Zea mays sepanjang 2 mm.
3.      Melakukan fiksasi dengan memakai larutan Formalin-Aceton-Alkohol (FAA) yaitu campuran larutan alkohol 96 % 90 ml, asam asetat glacial 5 ml, dan formalin 5 ml. Merendam jaringan ke dalam larutan FAA selama 1 jam.
4.      Merendam jaringan ke dalam aquades selama beberapa detik.
5.      Melakukan dehidrasi dengan merendam jaringan ke dalam alkohol bertingkat yaitu 70%, 80%, 90% dan 96% dengan interval waktu 15 menit.
6.      Melakukan dealkoholisasi dengan merendam jaringan ke dalam campuran alkohol - xylol 3 : 1, campuran alkohol - xylol 1 : 1 dan campuran alkohol - xylol 1 : 3, dan xylol, secara bertahap  dengan waktu masing-masing 10 menit tiap perendaman.
7.      Melakukan penjernihan dengan memasukkan jaringan ke dalam larutan xylol murni I dan larutan xylol murni II secara bertahap dengan waktu masing-masing 10 menit.
8.      Mencairkan parafin yang akan digunakan, setelah cair dimasukkan ke dalam wadah, kemudian rendam jaringan ke dalam parafin cair selama 30 detik.
9.      Memasukkan beberapa potong jaringan ke dalam kotak kubus yang didalamnya sudah terdapat parafin yang sudah memadat, lalu menuangkan kembali paraffin hingga seluruh bagian jaringan terendam.
10.  Membiarkannya hingga memadat.

.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Hasil
IV.1.1 Skema Laboratorium
       Fiksasi                       Formalin, Asam asetat glacial, dan alkohol 96%, selama 1 jam.

     Pencucian                   Aquadest selama beberapa detik.

     Dehidrasi                    Alkohol 70%, 80%, 90 %  hingga  96%, masing-masing selama 15 menit.

 Dealkoholisasi                Alkohol : xilol dengan perbandingan  3:1, 1:1 dan 1:3, masing – masing selama 10 menit.

   Penjernihan              Xylol murni I dan Xylol murni II, masing-masing selama 10 menit.
    Infiltrasi                     parafin cair, selama 30 detik.
   Penanaman                  Parafin diblok bersama preparat di kotak kubus


  Pemadatan                   Parafin memadat



IV.1.2 Skema Standar
           Fiksasi
                        FAA (Formalin  As.Asetat  Alkohol)              24 jam
                                       5ml           5 ml        90 ml   

           Aspirasi
                             Aspirator

          Dehidrasi
                                 (alkohol bertingkat 70%, 80%, 90% dan 96%)
                                               
Diganti tiap ½ jam
100 ml
 




Alkohol  : Xilol = 3 : 1, 1:1, 1:3
Xilol I                100 ml
Xilol II               
Diganti tiap 30 menit
      Dealkoholisasi
 





         Penjernihan
             
                               Xilol : Parafin            30 menit
                                     1 : 9

          Infiltrasi
                                Parafin lama diganti dengan parafin baru
                          
          Penanaman
 

                               Jaringan di blok bersama paraffin dalam kotak 3 x 3 cm

          Pengirisan
 

                               Mikrotom

          Pelekatan
                               Gliserin/albumin + air

         Pewarnaan
                               Safranin

Penutupan dengan deg glass

Pengamatan di bawah mikroskop

IV.1.3  Gambar Preparat
2
3
4
1










Keterangan:
1.      Epidermis (lapisan luar)
2.      Korteks (jaringan dasar)
3.      Floem (pembuluh tapis)
4.      Xylem (pembuluh kayu)
IV.2  Pembahasan
Percobaan kali ini, kelompok kami menggunakan bahan yaitu batang tanaman jagung Zea mays yang dipotong secara melintang dengan panjang 2 mm. Setelah dipotong, jaringan kemudian melalui tahap fiksasi dengan menggunakan larutan FAA (Formalin, Asam asetat glasial, dan alkohol 96%), tahap ini bertujuan untuk menjaga atau mengawetkan seluruh stuktur sel sehingga sedapat mungkin berada dalam keadaan sama atau hampir sama dengan keadaan aslinya pada waktu masih hidup serta memperlambat atau menghentikan proses metabolism sel pada jaringan. Larutan FAA yang digunakan bertujuan untuk mempercepat penetrasi alkohol dan asam asetat ke dalam jaringan agar pematian dan  fiksasi  dapat  berjalan dengan cepat, serta merupakan larutan yang stabil dan
pengawet yang baik.
Setelah difiksasi, jaringan terlebih dahulu dicuci dengan merendamnya ke dalam aquades selama beberapa detik. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan larutan FAA yang ada pada jaringan. Kemudian, jaringan melalui tahap dehidrasi dengan menggunakan alkohol bertingkat dengan konsentrasi mulai dari 70%, 80%, 90%, dan 96%. Jaringan direndam ke dalam alkohol bertingkat dengan waktu masing-masing selama 15 menit. Tujuan dari tahap dehidrasi ialah agar kandungan air dalam jaringan jagung Zea mays keluar. Penggunaan dari alkohol bertingkat tersebut agar jaringan kandungan airnya dapat keluar sedikit demi sedikit hingga pada konsentrasi 96% pengeluaran airnya pun maksimal, serta mencegah terjadinya lisis pada sel dalam jaringan tersebut.
Selanjutnya, jaringan direndam ke dalam larutan campuran alkohol 96% : xylol  secara bertingkat dengan perbandingan 3:1, 1:1, dan 1:3 masing-masing selama 10 menit yang biasa disebut dengan tahap dealkoholisasi. Tahap ini bertujuan untuk mengeluarkan alkohol yang terdapat di dalam jaringan yang kemudian digantikan oleh larutan xylol yang mampu berikatan dengan parafin. Selain itu, tujuan dari perbandingan pada campuran tersebut dimana campuran alkohol : xylol pertama ialah 3 : 1 agar  sel tidak kaget akan penambahan larutan lain sehingga mencegah kerusakan pada sel.
Tahap berikutnya ialah penjernihan dimana jaringan direndam ke dalam larutan xylol murni I dan xylol murni II dengan waktu masing-masing 10 menit. Langkah ini dilakukan untuk mengeluarkan alkohol yang masih tersisa dalam jaringan sehingga larutan dalam jaringan hanya larutan xylol saja. Selanjutnya, jaringan direndam ke dalam campuran larutan xylol : parafin dengan perbandingan  1 : 9.  Hal ini dilakukan untuk menghilangkan xylol dari jaringan. Selanjutnya jaringan mengalami tahap infiltrasi, dimana jaringan direndam ke dalam parafin cair murni selama 30 detik yang bertujuan untuk menghilangkan kandungan xylol-nya secara maksimum serta untuk merekatkan jaringan.
Setelah tahap infiltrasi, dilakukan proses penanaman atau embedding dengan cara merendam  jaringan dalam parafin murni selama 15 menit diudara terbuka dan 15 menit di dalam oven, kemudian setelah mencair jaringan dimasukkan ke dalam kertas kubus yang disebut blok dan dituangkan kembali parafin murni kemudian dibiarkan pada suhu kamar agar parafin membeku selama. Hal ini bertujuan agar jaringan dapat dengan mudah terpotong tanpa merusak jaringan batang tersebut.
Percobaan yang kami lakukan hanya sampai pada tahap penanaman. Hal ini karena rusaknya mikrotom di laboratorium sehingga yang diajarkan hanya sebatas teknik pembuatan preparat sebelum pewarnaan. Pada percobaan ini terjadi kesalahan dalam prosedur dimana parafin yang digunakan tidak mampu memadat pada suhu kamar sehingga terjadi pengulangan percobaan. Penggunaan parafin cair tidak efektif karena titik padat yang dimiliki berada di bawah suhu kamar, sedangkan penggunaan parafin padat akan memudahkan proses karena titik padat parafin padat ada pada suhu kamar.









BAB V
PENUTUP

V.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa proses pembuatan preparat yang sempurna terdiri dari proses fiksasi, dehidrasi, dealkoholisasi, infiltrasi, penanaman, pengirisan, dan pewarnaan. Namun, karena rusaknya mikrotom di laboratorium, proses yang dilakukan hanya terbatas yakni hingga pada tahap penanaman.

V.2 Saran
Sebaiknya alat-alat dalam laboratorium lebih diperhatikan serta dalam kondisi bisa digunakan untuk menunjang jalannya proses praktikum yang dilakukan.













DAFTAR PUSTAKA

Rindi, Daniswara, 2011. Membuat Preparat Organ. http://wararindi.blogspot.com/. Diakses pada tanggal 19 September 2012, pukul 21.20 WITA. 

Imron, Tamyis, A., 2008. Pembuatan Preparat Jaringan Tumbuhan dengan Metode Parafin. Lap.prak mikroteknik Universitas Brawijaya. http://cyber-biology.blogspot.com. Diakses pada tanggal 19 September 2012, pukul 21.22 WITA. 

Johansen, D. A., 1940. Plant Microtechnique. Ist ed. McGraw-Hill Publications in the Botanical Sciences. New York.

Sugiharto, 1989. Mikroteknik. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat           Jendral Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Ilmu Hayat Institut              Pertanian Bogor. Bogor.

Sumardi, I. dan Pudjoarinto, A., 2004. Struktur Perkembangan Tumbuhan.            Universitas Hasanuddin. Makassar.
















LAMPIRAN

Pengenceran Alkohol
Ø  Pengenceran 90%
   M1 V1  =  M2 V2
96  .  V1 = 90  .  100
                 V1    =   93,75
  100   93,75  =  6,25 ml
Jadi, alkohol  = 93,75 ml dan aquades = 6,25 ml.
Ø  Pengenceran 80%
  M1V1 = M2V2
       93,75 . V1  =  80 . 100
                  V1  =  85,33
  100 – 85,33   =   14,67 ml
Jadi, alkohol  = 85,33 ml dan aquades = 14,67 ml.
Ø  Pengenceran 70%
M1V1 = M2V2
       85,33.V1 = 70.100
                 V1 = 82,03
  100 – 82,03 = 17,97 ml
Jadi, alkohol  = 82,03 ml dan aquades = 17,97 ml.

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar